Большую роль сыграла Куйбышевская железная дорога во время Великой Отечественной войны, связывая тыл с фронтом. За 1941-1945 годы по ее стальной колее перевезено 19 млн вагонов с грузами, в том числе около 1 млн цистерн. Более 141 млн рублей было собрано тружениками магистрали в Фонд обороны. На эти деньги построено 10 бронепоездов и 80 санитарных поездов. Более 14 тыс. куйбышевских железнодорожников воевали на фронтах, из них 23 стали Героями Советского Союза.

В короткие сроки по Куйбышевской железной дороге на Урал, в Западную Сибирь, Поволжье и другие районы страны было перевезено оборудование 1360 крупных промышленных предприятий, эвакуировано свыше 10 млн человек.

В это время на дороге осваивались новые методы труда: скоростное формирование поездов, безотцепочный ремонт вагонов, вождение тяжеловесных составов, отправление сдвоенных поездов. Для повышения пропускной способности участков с октября 1941 года на дороге была введена «живая блокировка»: пропуском составов управляли люди, расставленные на расстоянии видимости